Titov sinh ra ở làng Verkhneye Zhilino ở Altai Krai và đi học tại trường hàng không quân sự Stalingrad. Sau khi tốt nghiệp ngành phi công không quân, ông được chọn đào tạo phi hành gia vũ trụ vào năm 1960.

Ông đã bay thực hiện nhiệm vụ Vostok 2 vào ngày 6 tháng 8 năm 1961. Chuyến bay kéo dài trong 25,3 giờ và ông thực hiện bay 17 vòng quanh quỹ đạo của Trái Đất. Tín hiệu phát đáp của ông là Oryol (tiếng Nga: Орёл), có nghĩa là "Đại bàng". Ông đã hạ cánh xuống gần thị trấn Krasnoy Kut ở tỉnh Saratov, Nga. Vào thời điểm chuyến bay, vẫn còn một tháng mới đến sinh nhật lần thứ 26 của Titov, do vậy, ông vẫn là người trẻ nhất từng bay trong vũ trụ.[6][7] Như hầu hết các nhà du hành vũ trụ của Liên Xô, Titov cũng là một đảng viên của Đảng Cộng sản Liên Xô.

Ông là người đầu tiên bị bệnh không gian (say không gian) và cũng là người đầu tiên ngủ trong không gian. Ông đã ngủ một khoảng thời gian ngắn trên quỹ đạo và rất ngạc nhiên khi thức dậy với hai cánh tay lơ lửng trong không trung do không có trọng lực bình thường. Ông trở lại giấc ngủ sau khi đặt tay trong đai bảo hộ, sau đó ngủ nhiều hơn 30 phút so với dự đoán của kế hoạch bay. Ông nói rằng "Một khi bạn xếp được tay và chân vào vị trí hợp lý, ngủ trong không gian sẽ ổn thôi... Tôi ngủ như một đứa bé".[8]

Mặc dù ông bị bệnh không gian trong chuyến bay quỹ đạo của mình, Titov đã ăn mừng khi hạ cánh. Lễ kỷ niệm của ông được mô tả như là "một cơn hưng phấn" sau khi hạ cánh, và trên chuyến bay trở về Kubishev để kiểm tra lại, ông đã làm các nhân viên y tế náo động vì đã mở và rót bia, vi phạm hoàn toàn các quy tắc được hướng dẫn.[9]

Sau khi hạ cánh, Titov được chuyển đến bệnh viện xét nghiệm thêm để đảm bảo rằng ông không bị bệnh. Sau khi nhiệm vụ được đóng lại, ông bị các báo cáo cho rằng đã tham gia vào các hành vi có thể được xem là không thể chấp nhận được đối với một người làm việc trong chương trình không gian.[9] Ông bị cho là đã mê đắm tình ái với phụ nữ, uống rượu quá mức và phóng xe hơi tốc độ cao, khiến một số người đưa ra giả thuyết rằng hành vi của ông có khả năng là một tác dụng phụ khác của chứng bệnh không gian mà ông đã trải qua do tình trạng không trọng lực. Các thử nghiệm sau đó đã cho thấy đây không hoàn toàn chính xác trong tất cả trường hợp.

Trong chuyến thăm được công bố rộng rãi tới Seattle năm 1962 để tham quan Hội chợ Thế kỷ 21, Titov được các phóng viên hỏi về chuyến bay vào vũ trụ của ông ảnh hưởng đến triết lý sống của mình như thế nào. Ông trả lời: "Đôi khi mọi người nói rằng Chúa ở ngoài đó. Tôi đã chăm chú nhìn xung quanh cả ngày nhưng tôi không tìm thấy ai ở đó. Tôi không thấy thiên thần hay Thiên Chúa."[10] Câu nói nổi tiếng này được sử dụng thường xuyên trong các tuyên truyền chống tôn giáo của Liên Xô, nhưng nó thường bị gán sai cho Yuri Gagarin.[11]

Sau chuyến bay vào vũ trụ, Titov đảm nhận nhiều vị trí cấp cao khác nhau trong chương trình không gian của Liên Xô cho đến khi nghỉ hưu năm 1992. Năm 1995, ông được bầu vào Duma Quốc gia với tư cách là thành viên của Đảng Cộng sản. Ông qua đời vì ngừng tim trong phòng tắm hơi ở tuổi 65 tại Moskva.[12] Ông được chôn cất tại Nghĩa trang Novodevichy.